Soluciones de recubrimiento con pulverización catódica y crío-fractura
Para obtener imágenes de alta calidad de muestras con microscopio electrónico de barrido (SEM) o de transmisión (TEM), sus muestras deberán ser conductoras para así evitar la carga. Si una muestra no tiene una conductividad lo suficientemente alta, puede cubrirla rápidamente con una capa conductora utilizando el método de recubrimiento de pulverización catódica. También se puede utilizar un recubrimiento de evaporador de carbono o de haz de electrones e-beam. Estos recubrimientos protegen la muestra, permiten mejorar el contraste de la imagen para EM o pueden actuar como película de soporte de la cuadrícula TEM para muestras a pequeña escala.
La técnica de recubrimiento más adecuada a utilizar dependerá de las propiedades de la muestra, el tamaño de las estructuras que desea analizar y los métodos necesarios para prepararla para la obtención de imágenes EM. Para algunas aplicaciones avanzadas, tendrá que aplicar la crío-fractura y posiblemente crío-grabar las muestras. En ese caso, necesitará un instrumento que tenga la capacidad de transferir en frío, que cubra la muestra en condiciones criogénicas y que fracture la muestra con una cuchilla criogénica.
Las soluciones de recubrimiento Leica cubren una amplia gama de necesidades, desde recubrimientos realizados en una máquina de recubrimiento por pulverización catódica de bajo vacío a temperatura ambiente hasta los que se realizan en vacío alto e incluso a temperaturas criogénicas. Los instrumentos están diseñados para mejorar y optimizar sus flujos de trabajo de preparación de muestras, desde los recubrimientos básicos hasta las aplicaciones de crío-fractura más avanzadas.
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¿Por qué necesito recubrir mis muestras para microscopio electrónico (EM)?
En el caso de las imágenes de EM, una muestra que no sea conductora por naturaleza deberá recubrirse con una capa conductora para inhibir los riesgos de carga y daños térmicos en la muestra. En algunos casos, las películas metálicas delgadas también ayudan a mejorar la señal de emisión de electrones secundarios.
¿Cuándo debo aplicar un recubrimiento con carbono?
Los recubrimientos de carbono (C) se utilizan comúnmente como película de soporte para la microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las películas finas de carbono suelen tener unos cuantos nanómetros de grosor y se depositan en las rejillas de los TEM. Son finos, fuertes y transparentes a los electrones. También se utiliza un recubrimiento de carbono como capa protectora.
¿Para qué aplicaciones se utiliza la crío-fractura?
Para revelar las estructuras finas internas de una muestra biológica u orgánica, la muestra puede enfriarse a temperaturas criogénicas y romperse físicamente. Una vez recubierta con una capa conductora, las estructuras finas expuestas de la muestra se pueden examinar con un microscopio electrónico (EM). Tradicionalmente, la crío-fractura se utiliza para aplicaciones biológicas, como la investigación de estructuras subcelulares, p. ej., orgánulos y membranas. Sin embargo, más recientemente la técnica se ha vuelto interesante para ciertas aplicaciones en la ciencia de los materiales y la física en relación con las capas y emulsiones.
Losrecubridores de pulverización catódica de bajo vacío permiten una deposición de película delgada para aplicaciones SEM con demandas moderadas de aumento. Las muestras se pueden recubrir con pulverización catódica con oro (Au), así como con otros materiales adecuados, como platino (Pt) y oro/paladio (Au/Pd).
Los recubridores de pulverización catódica de alto vacío depositan películas delgadas con una estructura de grano mucho más fina, lo que permite un análisis SEM de alta resolución. Además, se puede pulverizar una gama más amplia de materiales, incluidos metales oxidables. Algunos ejemplos son el iridio (Ir), el tungsteno (W) o el titanio (Ti). En ocasiones, el cromo (Cr) se pulveriza para formar una capa amortiguadora. Además, las recubridoras de alto vacío se pueden configurar para aplicaciones más avanzadas y una deposición multicapa.
Para obtener más información, consulte los artículos
www.leica-microsystems.com/science-lab/expert-knowledge-on-high-pressure-freezing-and-freeze-fracturing-in-the-cryo-sem-workflow
www.leica-microsystems.com/science-lab/brief-introduction-to-freeze-fracture-and-etching
El recubrimiento
Se recubre una muestra con una capa conductora de carbono o metal para inhibir la carga, para reducir el daño térmico y mejorar la señal de los electrones secundarios para el examen topográfico en el SEM. Para el análisis TEM de muestras, se utilizan rejillas recubiertas de carbono o la propia muestra podría necesitar una fina capa de recubrimiento encima. La línea de recubridores de Leica Microsystems incluye la recubridora de alto vacío Leica EM ACE600 para el análisis de la más alta resolución en FE-SEM y TEM y la pulverizadora/recubridora de roscas de carbono Leica EM ACE200 como sistema totalmente automatizado que permite un manejo rápido, cómodo e intuitivo.
La crío-fractura
Para revelar las estructuras internas de una muestra congelada, se puede romper físicamente esa muestra y exponer esas estructuras para su posterior examen con un microscopio electrónico. El sistema de preparación de muestras Leica EM ACE900 lleva la técnica de la crío-fractura a un nuevo nivel, con un micrótomo avanzado, opciones flexibles de sombreado con fuentes de haces electrónicos e-Beam, una plataforma crio-giratoria y un sistema de transferencia con bloqueo de carga. Esta técnica tiene como resultado el análisis de alta resolución de réplicas en el TEM y, cuando se combina con el Leica EM VCT500, se pueden generar imágenes de la cara del bloque en el crío-SEM. El Leica EM ACE600 está equipado con una plataforma criogénica y una conexión VCT500 que proporciona una solución para aplicar la crío-fractura y obtener imágenes de la superficie visible en un crío-SEM.
El crío-etching
El crío-etching es un paso opcional posterior a la crío-fractura de la muestra que revela más información de las caras fracturadas. Esto se consigue sublimando las capas de hielo superficial bajo vacío para exponer los elementos celulares que originalmente yacían ocultos. La temperatura de la etapa y el vacío influyen en la velocidad del grabado. La obtención de la reproducibilidad requiere un control preciso de la temperatura. Como instrumento altamente versátil, la crío-recubridora Leica EM ACE900 ofrece los mejores resultados para las técnicas de la crío-fractura y el crío-etching para el análisis TEM y crío-SEM.
