극저온 전자 단층 촬영술
극저온 전자 단층 촬영술(CryoET)는 세포 환경 내의 생체 분자를 1 nm 이하의 엄청난 해상도로 관찰하는 데 사용되며, 분자 사회학을 이해하는 새로운 창을 엽니다. 이러한 척도는 별도의 표지 없이도 개별 단백질을 형상에 따라 단독으로 식별할 수 있는 수준입니다. 하지만 1 nm 해상도 이하의 영상촬영에는 중요한 문제가 있습니다. 즉, 관심 영역을 정확하게 찾고 타겟팅해야 합니다.
Leica Microsystems의 최첨단 cryoET 솔루션은 신속한 고해상도 영상촬영이 가능하고, 이미지 데이터를 정밀하게 전송하면서 작업 중 최적의 극저온 조건을 유지할 수 있습니다.
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극저온 전자 단층 촬영술이란 무엇입니까?
극저온 전자 단층 촬영술(또는 전자 극저온 단층 촬영술)을 사용하면 원래의 기능 상태에서 3차원 분자 해상도로 단백질-단백질 상호 작용을 분석할 수 있습니다. 샘플은 일련의 제어된 위치로 기울어지면서 여러 개의 2차원 이미지로 영상촬영됩니다. 이미지 "슬라이스"를 결합하여 샘플을 3D로 재구성합니다.
일반적인 CryoET 작업 중 발생하는 문제는 무엇입니까?
일반적인 CryoET 작업과 관련된 가장 큰 문제는 영상촬영할 세포 또는 단백질을 함유하는 관심 영역을 정확하게 식별하는 과정의 어려움입니다. 타겟팅이 반복적으로 실패하면 시간이 소비되는 과정을 반복해야 하기 때문에 고가의 전자 현미경(EM) 영상촬영 시간을 허비하게 됩니다. 또 다른 2가지 문제는 시료 품질 및 얼음 두께를 일관되게 확보해야 한다는 것과 극저온 TEM으로 전달하기 전에 시료를 적절하게 유리화시켜야 한다는 것입니다.
고해상도 극저온 단층 촬영을 수행하려면 영상촬영된 시료의 슬라이스 두께가 300 nm 이하여야 합니다. 세포 몸체와 같은 시료의 "두꺼운" 부분을 관찰하려면 샘플이 얇아야 합니다. 냉동미세절단 외에도 전용 또는 다중 형식 극저온 스캐닝 전자 현미경을 사용을 위한 집속 이온빔(FIB) 밀링이 선택 가능한 방법입니다. 2개의 이온빔 창을 배치하여 Cryo ET 촬영술이 가능하도록 약 200 nm의 두꺼운 얼음 시트(박층)의 관심 영역을 생성합니다.
이제 준비된 샘플은 극저온 전송 전자 현미경으로 스캔할 수 있으며, 나중에 데이터 재구성 절차를 통해 2D 이미지를 하나의 3D 모델로 재구성해야 합니다.
극저온 광학 현미경으로 CryoET 관련 문제를 해결하는 방법
극저온 광학 현미경은 2가지 방법으로 CryoET 작업에 긍정적으로 기여할 수 있습니다.
첫째, 광학 현미경은 샘플 품질을 평가하도록 돕습니다. 극저온 광학 현미경은 샘플의 냉동 품질과 얼음 두께, 추가 처리를 위해 샘플 분포가 최적화되었는지 여부를 빠르게 파악할 수 있습니다. Leica의 극저온 솔루션을 사용하며 이러한 단계에서 샘플을 안전하고 생존 가능하도록 유지할 수 있습니다.
두 번째로, 탁월한 작업 효율성을 전달ㄹ하는 극저온 광학 현미경의 놀라운 잠재력은 많은 시간과 비용이 소비되는 CryEM 촬영을 시작하기 전에 관심 구조를 더 정밀하게 타겟팅할 수 있다는 것입니다. Leica의 극저온 광학 현미경 솔루션을 통해 다음 단계의 EM 촬영을 위해 타겟팅된 구조의 이미지 및 좌표를 내보낼 수 있어 EM 영상촬영 시간을 대폭 감소시킵니다.
상단 SEM 보기(촤즉 창) 및 FIB 보기(우측 창)를 포함한 초고해상도 3D 공초점 이미지 오버레이. 상관 관계를 위한 랜드마크로 비드를 사용하여 오버레이를 수행함. HeLa 세포 표지 방법: Hoechst의 핵, 청색; MitoTracker Green의 미토콘드리아, 녹색; Bodipy and Crimson Beads의 지질 방울, 적색). 스케일바: 20μm. 세포는 Ievgeniia Zagoriy에서 제공되었고 SEM/FIB이미지들은 Germany, Heidelberg, EMBL, Mahamid-Group, Herman Fung에서 제공됨.
