O que é Tomografia Crioeletrônica?
A tomografia crioeletrônica (também conhecida como criotomografia de elétrons) permite que as interações proteína-proteína sejam analisadas em resolução molecular tridimensional em seu estado nativo e funcional. A imagem da amostra é adquirida em uma série de imagens bidimensionais, ao ser inclinada em uma série de posições controladas. As "lâminas" da imagem resultantes podem, então, ser combinadas para produzir uma reconstrução 3D da amostra.
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Quais são as etapas de um fluxo de trabalho CryoET?
A técnica envolve a preparação de amostras, que estão em grades de microscopia eletrônica e, em seguida, rapidamente mergulhá-las, congelando em nitrogênio líquido para vitrificar a amostra e evitar a formação de cristais de gelo.
Para realizar a criotomografia de alta resolução, a espessura da lâmina adquirida da amostra não deve ser maior que 300 nm. Para a observação de partes "mais espessas" das amostras, como corpos de células, a amostra deve ser reduzida. Além da ultramicrotomia criogênica, a fragmentação de feixes de íons focalizado (FIB) usando um microscópio eletrônico de varredura criogênica multimodal ou dedicado é o método preferencial. Duas janelas de feixes de íons são posicionadas de forma que uma lâmina de gelo fina (lamelar) de cerca de 200 nm de espessura seja criada na área de interesse para torná-la acessível ao Cryo ET.
As amostras preparadas podem agora ser varridas com o microscópio eletrônico de transmissão criogênica e, posteriormente, o processo de reconstrução de dados deve ocorrer para reconstruir as imagens 2D em um único modelo 3D.
Quais são os desafios em um fluxo de trabalho CryoET típico?
O maior desafio associado a um fluxo de trabalho CryoET típico está relacionado à dificuldade de identificar a área precisa de interesse contendo a célula ou proteína cuja imagem deverá ser adquirida. Falhas repetidas ao mirar podem resultar em várias repetições de um processo demorado, que, por fim, desperdiça o caro tempo de aquisição de imagens por microscópio eletrônico (ME). Dois outros desafios no fluxo de trabalho incluem garantir que a qualidade da amostra e a espessura do gelo sejam consistentes em todo o processo, bem como manter as amostras vitrificadas adequadamente antes de serem transferidas para o TEM criogênico.
Como os desafios do CryoET podem ser superados com a microscopia óptica criogênica?
A microscopia óptica criogênica pode contribuir positivamente para o fluxo de trabalho CryoET de duas maneiras importantes.
Primeiramente, a microscopia óptica ajuda a avaliar a qualidade da amostra. O microscópio óptico criogênico oferece uma visão geral rápida da qualidade do congelamento e da espessura do gelo da amostra, além de avaliar se distribuição da amostra é ideal para processamento posterior. As soluções criogênicas da Leica garantem que as amostras sejam mantidas seguras e viáveis durante essas etapas.
Em segundo lugar, o maior potencial do microscópio óptico criogênico para maior eficiência do fluxo de trabalho é a capacidade de mirar a estrutura de interesse com muito mais precisão antes do início das preparações crioEM demoradas e dispendiosas. As soluções de microscopia óptica criogênica da Leica permitem a exportação de imagens e coordenadas da estrutura direcionada para etapas subsequentes de ME, reduzindo, assim, o tempo de aquisição de imagens EM.
Apresentando o Coral Cryo: o fluxo de trabalho CryoET mais eficaz
As soluções exclusivas de fluxo de trabalho de tomografia crioeletrônica 3D da Leica superam os desafios típicos, garantindo viabilidade da amostra, verificações de qualidade e, acima de tudo, um mecanismo de mira 3D preciso e confiável. Use nosso hardware otimizado, incluindo platina criogênica e shuttle, em conjunto com o avançado software de direcionamento CryoET, além de uma variedade de opções de integração e transferência perfeitas para platinas criogênicas FIB ou VCT.
Revele a mira de volume 3D precisa
Descubra como o fluxo de trabalho da tomografia criogênica eletrônica integrada Coral Cryo da Leica Microsystems usa a super-resolução confocal para mirar sua estrutura de interesse com mais precisão. O fluxo de trabalho reduz e otimiza o número de etapas, melhora o carregamento e a transferência de amostras e, portanto, aumenta a produtividade do fluxo de trabalho CryoET.
Sobreposição de uma imagem confocal 3D super-resolvida com visualização SEM superior (painel esquerdo) e visualização FIB (painel direito). O revestimento foi realizado usando as microesferas como pontos de referência para a correlação. Células HeLa marcadas da seguinte forma: núcleos por Hoechst, azul; mitocôndria por MitoTracker Green, verde; gotículas lipídicas por Bodipy e Crimson Beads, vermelho). Barra de escala: 20 µm. Células gentilmente fornecidas por Ievgeniia Zagoriy e imagens SEM/FIB, por Herman Fung, Mahamid-Group, EMBL-Heidelberg, Alemanha.
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Feature | Confocal | THUNDER (Widefield) |
|---|---|---|
| Sensibilidade | * | |
| Velocidade | * | |
| Resolução lateral | ** | * |
| Resolução axial | ** | * |
| Otimização da excitação e emissão de corantes para condições de aquisição de imagens criogênicas | ** | * |
| Supressão de autofluorescência (camada de amostra ou carbono) | * | |
| Mira e exportação | 3D | 2D |
