Auflösung und numerische Apertur
Die numerische Apertur (NA) hängt mit dem Brechungsindex (n) eines lichtdurchlässigen Mediums sowie mit der Winkelöffnung (α) eines bestimmten Objektivs zusammen (NA = n sinα). Die Auflösung eines Lichtmikroskops hängt nicht nur von der NA eines Objektivs ab, sondern von der NA des gesamten Systems, wobei die NA des Mikroskopkondensors berücksichtigt wird. In einem Mikroskopsystem, in dem alle optischen Komponenten korrekt ausgerichtet sind, einen relativ hohen NA-Wert haben und harmonisch zusammenarbeiten, werden mehr Bilddetails aufgelöst. Die Auflösung hängt auch mit der Wellenlänge des Lichts zusammen, das zur Abbildung einer Probe verwendet wird; Licht mit kürzeren Wellenlängen kann mehr Details auflösen als Licht mit längeren Wellenlängen.
Es gibt drei mathematische Konzepte, die im Zusammenhang mit der Auflösung berücksichtigt werden müssen: Das Abbe-Limit, die Airy-Scheibchen und das Rayleigh-Kriterium. Jedes dieser Konzepte wird im Folgenden in chronologischer Reihenfolge behandelt.
George Biddell Airy und „Airy-Scheibchen“ (1835)
George Biddell Airy (1801-1892) war ein englischer Mathematiker und Astronom. Im Jahr 1826 (im Alter von 25 Jahren) wurde er zum Professor für Mathematik am Trinity College ernannt, zwei Jahre darauf zum Professor für Astronomie am neuen Observatorium in Cambridge. Von 1835 bis 1881 war er der „Astronomer Royal“. Ihm zu Ehren wurde sogar ein Mond- und Marskrater benannt.
Ebenfalls im Jahr 1835 veröffentlichte er in den "Transactions of the Cambridge Philosophical Society" eine Arbeit mit dem Titel „On the Diffraction of an Object-Glass with Circular Aperture“ [1]. Airy schrieb diese Arbeit aus der Sicht eines Astronomen und beschrieb darin „die Form und Helligkeit der Ringe oder Strahlen, die das Bild eines Sterns umgeben, wie man es in einem guten Teleskop sieht“. Obwohl er für ein anderes wissenschaftliches Gebiet schrieb, sind diese Beobachtungen auch für andere optische Systeme, einschließlich Mikroskope, relevant.
Ein Airy-Scheibchen ist der optimal fokussierte Lichtpunkt, der durch eine kreisförmige Öffnung in einem perfekt ausgerichteten und durch Beugung begrenzten System bestimmt werden kann. Von oben betrachtet (Abbildung 1) erscheint dies als ein heller Lichtpunkt, um den sich konzentrische Ringe oder Wellen bilden (korrekter als Airy-Muster bezeichnet).
Das Beugungsmuster wird durch die Wellenlänge des Lichts und die Größe der Blende, durch die das Licht fällt, bestimmt. Der zentrale Punkt des Airy-Scheibchens enthält etwa 84 % der Lichtintensität, die restlichen 16 % befinden sich im Beugungsmuster um diesen Punkt herum. Bei der Betrachtung einer Probe mit einem Mikroskop gibt es natürlich viele Lichtpunkte, und es ist zutreffender, von zahlreichen Airy-Mustern zu sprechen, als von einem einzelnen Lichtpunkt, wie er mit dem Begriff „Airy-Scheibchen“ beschrieben wird.
Die dreidimensionale (3D) Darstellung des Airy-Musters, wie sie in der rechten Hälfte von Abbildung 1 zu sehen ist, wird auch als „Punktspreizfunktion“ (PSF) eines optischen Instruments bezeichnet, das keine nennenswerte Aberration aufweist.
Ernst Abbe und das „Abbe-Limit“ (1873)
Ernst Karl Abbe (1840-1905) war ein deutscher Mathematiker und Physiker. Im Jahr 1866 lernte er Carl Zeiss kennen und gründete mit ihm die so genannten „Zeiss optische Werkstätte“, die heute unter dem Namen Zeiss bekannt sind. Darüber hinaus war er 1884 Mitbegründer der Schott-Glaswerke. Abbe war auch die erste Person, die den Begriff der numerischen Apertur definierte. Im Jahr 1873 veröffentlichte Abbe seine Theorie und Formel, die die Beugungsgrenzen des Mikroskops erklärte [2]. Abbe erkannte, dass Probenbilder aus einer Vielzahl sich überlappender, beugungsbegrenzter Punkte (oder Airy-Scheibchen) mit unterschiedlicher Intensität zusammengesetzt sind.
Um die Auflösung, d = λ/(2NA), zu erhöhen, muss die Probe entweder mit einer kürzeren Lichtwellenlänge (λ), durch ein Abbildungsmedium mit einem relativ hohen Brechungsindex oder mit optischen Komponenten, die eine hohe NA aufweisen, betrachtet werden (oder auch eine Kombination all dieser Faktoren).
Doch selbst wenn man all diese Faktoren berücksichtigt, sind die Möglichkeiten eines normalen Mikroskops aufgrund der Komplexität des Gesamtsystems, der Transmissionseigenschaften von Glas bei Wellenlängen unter 400 nm und der Herausforderung, eine hohe NA im gesamten Mikroskopsystem zu erreichen, immer noch etwas begrenzt. Die seitliche Auflösung in einem idealen Lichtmikroskop ist auf etwa 200 nm limitiert, während die axiale Auflösung bei etwa 500 nm liegt (Beispiele für Auflösungsgrenzen sind unten aufgeführt).
John William Strutt und das „Rayleigh-Kriterium“ (1896)
John William Strutt, dritter Baron Rayleigh (1842-1919) war ein englischer Physiker und ein produktiver Autor. Im Laufe seines Lebens verfasste er erstaunliche 466 Publikationen, darunter 430 wissenschaftliche Abhandlungen. Er schrieb über so unterschiedliche Themen wie Vogelflug, psychische Forschung und Akustik. 1895 entdeckte er Argon (Ar), wofür er 1904 den Nobelpreis für Physik erhielt.
Rayleigh baute auf der Arbeit von George Airy auf und erweiterte sie, indem er 1896 die Theorie des „Rayleigh-Kriteriums“ erfand [3]. Das Rayleigh-Kriterium definiert die Grenze des Auflösungsvermögens in einem beugungsbegrenzten System, d. h. wann zwei Lichtpunkte voneinander unterscheidbar sind oder aufgelöst werden können.
Nach der Theorie der Airy-Scheibchen sind die Beugungsmuster von zwei einzelnen Airy-Scheibchen dann leicht voneinander zu unterscheiden, wenn sie sich nicht überlappen und „gut aufgelöst“ sind. Sie erfüllen damit das Rayleigh-Kriterium. Wenn sich das Zentrum einer Airy-Scheibe direkt mit dem ersten Minimum des Beugungsmusters einer anderen überschneidet, können sie als „gerade aufgelöst“ betrachtet werden und sind immer noch als zwei separate Lichtpunkte unterscheidbar (Abbildung 2, Mitte). Wenn die Airy-Scheiben näher beieinander liegen, erfüllen sie nicht das Rayleigh-Kriterium und sind nicht als zwei getrennte Lichtpunkte „aufgelöst“.
Halbwertsbreite (FWHM)
Ein praktischerer Ansatz für die Auflösung ist die Halbwertsbreite (englisch: full width at half maximum) der Intensität einer optisch nicht aufgelösten Struktur [4,5]. Dieser Wert ist mit einem Mikroskop relativ leicht zu messen und hat sich zu einem allgemein akzeptierten Parameter für Vergleichszwecke entwickelt. Der theoretische Wert für die FWHM ist RFWHM = 0,51λ/(NA), was ungefähr λ/(2NA) entspricht. Die FWHM als Auflösungsparameter liegt also sehr nahe am Abbe-Limit, kann aber auch anhand von Mikroskopbildern gemessen werden. Zur Kalibrierung oder zur Messung der Auflösungsgrenze werden häufig Kügelchen oder Kolloide mit verschiedenen Durchmessern abgebildet und gemessen.
Diese theoretischen Auflösungswerte, die auf physikalischen und mathematischen Annahmen beruhen, sind Schätzungen. Sie gehen von perfekten Abbildungssystemen und einer punktförmigen Lichtquelle im Vakuum oder einem völlig homogenen Material als Probe oder Präparat aus. Natürlich ist diese Annahme in der Realität fast nie der Fall, da viele Proben oder Präparate heterogen sind. Da nur eine begrenzte Menge an Licht durch die Probe hindurchgeht oder von ihrer Oberfläche reflektiert wird, hängt die messbare Auflösung wesentlich vom Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) ab.
Wie berechnet man die Auflösung eines Mikroskops?
Unter Berücksichtigung aller oben genannten Theorien wird deutlich, dass es bei der Berechnung der theoretischen Auflösungsgrenzen eine Reihe von Faktoren zu berücksichtigen gibt. Die Auflösung hängt auch von der Beschaffenheit der Probe ab. Betrachten wir die Berechnung der Auflösung anhand des Abbe-Limits, des Rayleigh-Kriteriums und der FWHM.
Zunächst sei daran erinnert, dass:
NA = n(sinα)
wobei n der Brechungsindex des Abbildungsmediums und α die Hälfte der Winkelöffnung des Objektivs ist. Die maximale Winkelöffnung eines Objektivs beträgt etwa 144º. Der Sinus der Hälfte dieses Winkels ist 0,95. Bei Verwendung eines Immersionsobjektivs mit Öl, das einen Brechungsindex von 1,52 hat, beträgt die maximale NA des Objektivs 1,45. Bei Verwendung eines Trockenobjektivs (ohne Immersion) beträgt die maximale NA des Objektivs 0,95 (da Luft einen Brechungsindex von 1,0 hat).
Die Abbe'sche Beugungsformel für die laterale (XY) Auflösung lautet:
d = λ/(2NA)
wobei λ die Wellenlänge des zur Abbildung einer Probe verwendeten Lichts ist. Bei Verwendung eines grünen Lichts von 514 nm und eines Ölimmersionsobjektivs mit einer NA von 1,45 liegt die (theoretische) Auflösungsgrenze bei 177 nm.
Die Abbe'sche Beugungsformel für die axiale (Z) Auflösung lautet:
d = 2λ/(NA)2
und wenn wir wiederum eine Wellenlänge von 514 nm annehmen, um eine Probe mit einem Objektiv mit einem NA-Wert von 1,45 zu beobachten, dann beträgt die axiale Auflösung 488 nm.
Das Rayleigh-Kriterium ist eine leicht verfeinerte Formel, die auf dem Abbe-Limit basiert:
R = 1,22λ/(NAobj + NAcond)
wobei λ die Wellenlänge des zur Abbildung einer Probe verwendeten Lichts ist. NAobj ist die NA des Objektivs. NAcond ist die NA des Kondensors. Der Wert „1,22“ ist eine Konstante. Dieser Wert wurde von Rayleighs Arbeit über Bessel-Funktionen abgeleitet. Diese werden für die Berechnung von Problemen in Systemen wie der Wellenausbreitung verwendet.
Unter Berücksichtigung der NA des Kondensors ist Luft (mit einem Brechungsindex von 1,0) im Allgemeinen das Abbildungsmedium zwischen dem Kondensor und dem Objektträger. Angenommen, der Kondensor hat eine Winkelöffnung von 144º, dann beträgt der NAcond-Wert 0,95.
Bei Verwendung eines grünen Lichts von 514 nm, eines Ölimmersionsobjektivs mit einer NA von 1,45 und eines Kondensors mit einer NA von 0,95 liegt die (theoretische) Auflösungsgrenze bei 261 nm.
Wie bereits erwähnt, kann die FWHM direkt aus der PSF gemessen oder nach folgender Formel berechnet werden:
RFWHM = 0,51λ/(NA).
Wiederum bei einer Lichtwellenlänge von 514 nm und einem Objektiv mit einer NA von 1,45 beträgt die theoretische Auflösung 181 nm. Dieser Wert liegt sehr nahe an der lateralen Auflösung, die oben anhand des Abbe-Limits berechnet wurde.
Wie bereits erwähnt, werden feine Details umso besser aufgelöst, je kürzer die Wellenlänge des zur Abbildung einer Probe verwendeten Lichts ist. Wenn also die kürzeste Wellenlänge des sichtbaren Lichts, 400 nm, mit einem Ölimmersionsobjektiv mit einer NA von 1,45 und einem Kondensor mit einer NA von 0,95 verwendet wird, dann wäre R gleich 203 nm.
Um die maximale theoretische Auflösung eines Mikroskopsystems zu erreichen, sollte jede der optischen Komponenten die höchste verfügbare NA aufweisen (unter Berücksichtigung der Winkelöffnung). Außerdem wird die Auflösung erhöht, wenn eine kürzere Wellenlänge des Lichts zur Betrachtung der Probe verwendet wird. Schließlich sollte das gesamte Mikroskopsystem korrekt ausgerichtet sein.
